※缺氧探針試劑盒的如何選擇？

Hypoxyprobe公司缺氧探針試劑盒核心組分為：缺氧探針（Pimonidazole 或CCI-103F）和缺氧探針的抗體。不同試劑盒中的探針和抗體標記不同。北京博蕾德生物是Hypoxyprobe公司總代理。現貨常備以下幾款缺氧探針試劑盒。
1) Hypoxyprobe™-1 Kit  此試劑盒適合于免疫熒光和免疫組化和流式檢測，探針抗體不帶標記，需要客戶自己搭配相應的二抗，比如：免疫組化，需要搭配抗小鼠IgG-HRP 二抗，免疫熒光或流式可搭配FITC-抗小鼠IgG-HRP（或者相應的其他標記二抗）。此試劑盒應用靈活方便，適合同時對組化和熒光檢測有需求的客戶，也方便客戶搭配不同的抗體標記，滿足不同的實驗需求。
2）Hypoxyprobe™-1 Plus Kit 此試劑盒適用于免疫熒光和免疫組化和流式檢測。不需要搭配二抗。如果做免疫熒光，只需要用到探針和FITC標記的探針抗體，這2個組分。如果做免疫組化，需要用到第3個組分：兔抗FITC-HRP標記的抗體。該試劑盒的優點是，同時滿足客戶做免疫熒光和免疫組化要求，不需要客戶自己搭配二抗。
3）Hypoxyprobe™-1 Omni Kit 此試劑盒與Hypoxyprobe™-1 Kit 不同的是探針的抗體來源不同，此試劑盒中的抗體為兔來源，探針抗體不帶標記，需要客戶自己搭配相應的二抗。比如：免疫組化，需要搭配抗兔IgG-HRP 二抗，免疫熒光或流式可搭配FITC-抗兔IgG-HRP（或者相應的其他標記二抗）。
4）Hypoxyprobe™ Green Kit 此試劑盒適合于免疫熒光和流式檢測。探針抗體為FITC直接標記，可直接用于免疫熒光檢測（直接免疫熒光）或流式檢測，不需要搭配二抗。需要注意研究的組織如有自發熒光（綠光），比如GFP(一些轉基因研究的客戶)，不適合這款試劑盒。可以選擇其他熒光標記的試劑盒，比如：Hypoxyprobe™ RedAPC（紅光）。
5）Hypoxyprobe™ RedAPC此試劑盒適合于免疫熒光和流式檢測。探針抗體為FITC直接標記，可直接用于免疫熒光檢測（直接免疫熒光）或流式，操作簡便，不需要搭配二抗。

※缺氧探針（派諾硝唑） 探針如何溶解？

派諾硝唑（Pimonidazole HCl）是弱堿性鹽酸鹽，水溶性非常好，建議溶解于中性緩沖液（生理鹽水或蒸餾水都可以）。這種水溶性特征有利于在腹腔和靜脈注射時，控制免疫劑量在0.1-0.5 mL之間。（派諾硝唑溶解度：116mg/ml）

※在缺氧標記時派諾硝唑（Pimonidazole HCl）免疫劑量是多少？

派諾硝唑與缺氧組織結合程度取決于硝基咪唑的還原率和組織相對派諾硝唑的結合率（結合率與派諾硝唑的濃度和作用時間成正比）。硝基咪唑的還原率很難預測，但是組織相對派諾硝唑的探針的結合率可以預測。以下是研究表明的給出的派諾硝唑的使用濃度：
1）在球狀組織可以檢測到強信號的缺氧標記染色，（ Exposure = 58mg/kg x 1 hour = 58mg/kg-hour.）
2）免疫劑量：0.5g/m2(14mg/kg)，在人腫瘤組織和正常細胞檢測到強信號的缺氧標記染色。血漿中的派諾硝唑的半衰期是5小時。（Exposure = 14 mg/kg x 5 hours = 70 mg/kg-hour.）
3）在小鼠腫瘤組織檢測到強信號的缺氧標記染色，免疫劑量：60mg/kg,血漿中Pimonidazole的半衰期是15min。（Exposure = 60mg/kg x 0.25 hours = 15 mg/kg - hour.）
總之，對于大小一致的小動物，比如：實驗室大鼠或小鼠，推薦的派諾硝唑的用量是：60mg/kg(kg:動物體重)，這個劑量是經濟有效的劑量。
由于血流效應，沒有毒性反應或沒有氧濃度變化的的小鼠或大鼠，劑量控制在30 mg/kg to 400 mg/kg 。對于移植腫瘤（在小鼠后肢）派諾硝唑探針劑100mg/kg。
需要注意的是：大于100mg/kg的劑量僅用于移植腫瘤。
對于體重不一致的大動物，具體用量取決于接觸表面積。對于人的來說，推薦的用量是：0.5g/m2 ，而對于狗0.28g/m2。
※缺氧探針（Hypoxyprobe-1）是否能進入缺氧腦組織或腫瘤組織。
Hypoxyprobe-1 是水溶性的，其對應游離基醇/水系數8.5，因此缺氧探針能夠自由進入腦組織以及腦腫瘤組織。

※派諾硝唑是否是體內檢測缺氧的合適的標記物？

派諾硝唑被認為是缺氧檢測的金標準標記物。其優點是：

1）水溶性好（116mg/ml 鹽水），這樣靜脈或腹腔免疫動物時，可以把免疫量（體積）控制在較小體積。其他的標記物，例如： CCI-103F 探針水溶性為10mol 或者更低，這個探針常用于花生油，DMSO 配成乳劑用于腹腔注射，避免血液稀釋。
2）穩定性好。固態探針4℃或常溫性質非常穩定，可以保存數年。高濃度的探針水溶液，避光4℃保存可以保存數年。探針的抗體，可以再4℃保存1年以上。
3）非危險化學品。對于小鼠，派諾硝唑探針的半數致死量（LD50）是：728mg/kg，因此被認為是低毒性的非危險化學品。
4）適用于各種免疫檢測。派諾硝唑探針檢測可以用各種檢測方法檢測，例如：免疫熒光、免疫組化，ELISA ，流式等。

※派諾硝唑的探針抗體是否可以用于小鼠組織的檢測？

是的。對于福爾馬林固定的石蠟組織，我們推薦HRP 標記的F（ab）2二抗（例如：HRP - Goat F(ab')2 Anti-Mouse Ig）。這樣會降低背景，可以用于不同種屬的動物檢測。

※探針激活和缺氧細胞結合原理是什么？

腫瘤乏氧細胞還原能力強，當具有電子親合力的硝基咪唑主動擴散透過細胞脂膜，在細胞內硝基還原酶作用下，硝基被還原，還原產物與大分子物質不可逆結合，滯留在組織內。而正常含氧細胞親電子硝基咪唑還原產物立即被氧化，從而用硝基咪唑類化合物在腫瘤內的代謝程度來反映腫瘤的乏氧。

※缺氧探針試劑盒中抗體（IgG1）濃度是多少？

Hp1-x盒子中抗體濃度：60ug/ml。Hp2-x, Hp6-x, Hp7-x,HP8-x,HP10-x中抗體濃度為500ug/ml，其它盒子中，兔來源的抗血清，沒有純化后的抗體IgG濃度確定確定。

※探針注射后，收貨組織的時間是什么時候？

在收獲組織過程中，組織會逐漸缺氧與探針結合，可能會出現一些假陽性。從時間上來講，組織與探針結合時間要比收獲組織時間長很多，因此在收貨組織這個短時間內，信號會很弱，因此在此期間探針濃度是有限的，出現的假陽性是可以忽略的。
對于人組織的研究，活組織檢查通常要在探針免疫后16-24小時后。探針在人血漿中的半衰期是5小時，因此16-24小時代表3-5個半衰期。也就是說在收貨組織時：只有1/8 到1/32的初始探針濃度殘留，組織固定后，較大程度的減少非特異性結合。
在其他的一些的人組織研究中，活組織檢查通常要在探針免疫1-1.5小時，然后組織立即液氮固定。這種操作方法，背景也會很低。盡管這個時候收獲組織：探針濃度在1.5-4小時內相對較高，組織固定時間相對探針和組織的作用時間太短，因此不會造成高背景。
對人組織的一些研究一些研究經驗，對實驗研究是很有指導意義的。探針免疫小鼠后，半衰期只有0.25小時。這種情況下，1-2小時收獲組織后，低溫快速冷凍固定，會終止非特異性結合。

※探針結合的氧分壓臨界值≤10mgHg是如何確定的？

A:在固體組織中很難確定硝基咪唑的氧化率。迄今為止，比較好的實驗方法是來自于Gross et al.’s，比較氧電極測量氧分壓和射線自顯跡法測量放射物標記法。甲氧甲基硝基咪唑結合的顆粒密度10mmHg氧分壓下，大量增加。其他的研究Chou et al. 也發現類似的結果。因此10 mm Hg是一個可信的探針與氧結合的臨界值。

已知的關于缺氧探針在小鼠組織的半衰期？

小鼠類型	血漿半衰期（min）	參考文獻
WH 雄性	22 ± 1	1
WHT雌性	22	2
C3H/He 雄性	28 ± 2; 23.5; 31.3;  24.6	3; 4; 5;  6

※ 動物內體的氧氮反應是否影響派諾硝唑的標記效果？

派諾硝唑的Piperidine基團很容易氧化成N-氧化物代謝物。原則上，會影響派諾硝唑的對缺氧組織的標記效率。動物體內，缺氧探針的氧氮反應是通過含黃素單氧化酶（FMO）激活完成的。FMO在不同動物中的分布是不同的，因此在不同動物種屬血漿中的氮氧化物水平是不同的。有趣的是，派諾硝唑的注射途徑（靜脈或口服）受血漿中氧氮物濃度影響很小。研究表明用：口服和靜脈注射派諾硝唑探針給狗的腫瘤（用CCI-103F作為缺氧標記的對照探針）。強氧化劑例如：過氧酸是由于超氧化物陰離子與NO反應，也可以氧化派諾硝唑探針。盡管這樣，NO的形成不會影響派諾硝唑的探針效果。
首先，通過還原血紅素鐵蛋白復合物 ，氧氮反應是可逆的以及通過組織還原酶，比如組織黃嘌呤脫氫酶以及還原細胞色素還原，派諾硝唑的氧化是有限的。
第二，通過其他探針的對照試驗說明，對缺氧的標記程度不受血漿中氧氮化合物影響。
第三， 氧氮衍生物與派諾硝唑抗體沒有交叉反應，因此對派諾硝唑的檢測沒有任何干擾。
※ 如果探針標記染色結果與組織缺氧結果不一致怎么辦？
迄今為止，通過派諾硝唑探針染色結果與組織缺氧檢測結果一般是一致的。
一般來講，如果對派諾硝唑的標記結果有疑問。一種方法是，對注射派諾硝唑的動物吸氧10%，如果吸氧10%后的動物派諾硝唑探針結合程度顯著提高，有可能缺氧有可能是由于派諾硝唑結合造成的。另一種方法是，用兩種缺氧探針標記檢測干預前后，組織氧壓的變化。